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特異鱟試劑制備的方法

發布時間: 2022-09-27  點擊次數: 1369次

自從1981年日本學者Kakinuma A 等報道“一種抗癌物質( 1-3) -β-D-葡聚糖[(1-3)-β-D-Glucan可使試劑凝聚"以來,由于其涉及細菌內毒素檢查的特異性,引起各國學者的注意。

 

 

一、(1-3-β-D-葡聚糖的本質與來源

 

Kakinuma A等在作抗癌物質葡聚糖熱原試驗時,不含發熱物質的葡聚糖能引起試驗呈陽性反應。Loretta APearsen FC也報道,血液透析器上存在試驗反應物質LAL-Reactive Materia l,LAL-RM,以后有報道凡經過銅銨人造絲透析膜的制品,均存在使試驗陽性但不是內毒素的物質。1983年日本學者中村隆范報道了這一物質具有如下結構:

 

1-3-β-葡聚糖外,1-41-6-β-葡聚糖同樣使試驗產生陽性結果,這些物質的總稱為真菌多糖Fungal polysaccharide,普遍存在于真菌細胞壁。如果這類物質具有像內毒素一樣的致熱活性,細菌內毒素檢查和熱原檢查結果的符合率會接近一致。但是恰恰相反,真菌多糖似乎不是一種致熱物質,文獻報道1.0、0.010. 0001mg/mL的真菌多糖溶液劑量按10mL/kg,進行熱原試驗的結果3h3只家兔最高升溫的均值分別為0.23±0.030.13±0. 090.20±0.10。這將導致在使用普通試劑檢測某些樣品時,出現細菌內毒素檢查不合格,熱原檢查合格的現象。造成對這些物質熱原檢查的錯判。1990Ikemura K等將試驗反應機理和各種干擾內毒素檢查物質及干擾部位歸納如下:

 

 

由此可知,鱟試劑檢測內毒素出現非特異性結果是不奇怪的。為了使細菌內毒素檢查與熱原檢查的結果趨向一致,使用特異試劑是*必要的。

 

二、特異試劑制備

 

1968Levin JBang F B創建試劑以來,使內毒素的檢測成為靈敏、快速、簡便的方法,已被舉世*,并被美、日、中、歐洲藥典以《細菌內毒素試驗》收載,但是由于上述非特異性的存在,使這一試驗的實際應用受到一定限制。為了克服這一弊端各國學者進行了深入研究。由于上述試驗反應機理已被闡明,設法阻止右側旁路反應,便能使試劑對內毒素的檢測達到特異性的目的。

 

日本最先推出的特異試劑其商品名為En-dospecy其生產工藝的特點是將普通試劑中存在的G因子,以親和層析方法分離去除。國內有人稱無G因子試劑。顯然,試劑中沒有G因子,即使被測樣品中存在真菌多糖非內毒素,也不能產生活化的G因子,在反應旁路系統中就不能激活凝固酶原,旁路反應被阻斷,使成為對內毒素具有特異性。

 

國內吳偉洪等報道以同樣方法制備了僅含CB因子的試劑。但是以這種工藝制備的特異試劑由于在分離G因子的過程中,必需防止帶入微量內毒素,即所用分離試劑、柱床、器皿及操作過程,嚴防內毒素污染,不僅增加了制備工藝的難度,也必然增加試劑的成本,因此很難推廣應用。

 

1989Berzofsty R N報道在制備普通試劑時,為了提高檢測內毒素的靈敏度,均采用氯仿提取存在于試劑粗制品中的抗LPS脂多糖因子。氯仿提取的結果確實增加了試劑的靈敏度,但同時將存在于試劑粗制品中的抗G因子一同除去,這就使普通試劑易被真菌多糖激活,增加了普通試劑的非特異性。因此提出不用氯仿提取,改用一種特殊試劑,只除去抗LPS因子,而保留抗G因子,以達到即增加了對內毒素的敏感性,又削弱了真菌多糖活性G因子的能力。這是從試劑的生產工藝上進行改革,實現提供商品特異試劑的一種方法。

 

1990Tsuchiya M報道,由于真菌多糖與普通試劑反應形成凝膠有一個特定濃度范圍10 -3~10-6mg/mL,大于或小于這個濃度都不能成膠故在制備普通試劑的基礎上,加入過量的真菌多糖( 1mg/mL),可阻止G因子的活化,“封閉"了旁路達到制備特異試劑的目的。顯然采用這一措施制備特異試劑,較以上兩種方法既簡便又經濟,可使特試劑商品化。

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